2 Mat�riels et m�thodes

Table des mati�res - Pr�c�dente - Suivante

2.1 Site d'essais
2.2 Mat�riels utilis�s
2.3 M�thodes
2.4 Essais en conteneurs
2.5 Essais r�alis�s dans des conditions semi-pratiques
2.6 Evaluation statistique

2.1 Site d'essais

Les essais se sont d�roul�s au Service national de la Protection des V�g�taux � Cacaveli, au Togo. La "Direction de la Protection des V�g�taux" (P.V.) est implant� au nord de Lom�, la capitale, � dix kilom�tres environ du centre ville. Le laboratoire dans lequel ont �t� effectu�s les essais en conteneurs se trouve dans un b�timent isol�. Les murs sont perc�s de fen�tres �troit es et d�pourvues de vitrage, ce qui emp�che largement la lumi�re de p�n�trer dans les locaux et a pr�serve ainsi les insectes d'une exposition intense au soleil. Vu le mode de construction ouvert, il r�gne dans le laboratoire le climat chaud et humide qui caract�rise le pays. Les conditions climatiques �taient par cons�quent identiques � celles rencontr�es par les col�opt�res dans leur milieu naturel.

Le laboratoire togolais ne poss�dant pas l'appareillage requis par ces travaux sp�ciaux, les agents pathog�nes des insectes ont �t� examines en Allemagne. Les examens ont eu lieu � Darmstadt, au d�partement de protection biologique des v�g�taux de l'institut biologique f�d�ral (BBA).

2.2 Mat�riels utilis�s

Constitution et entretien des �levages de Prostephanus truncatus

Les essais pr�vus n�cessitaient la mise en place de deux �levages distincts de P. truncatus. De mani�re � avoir en permanence suffisamment de mat�riel � inoculer, on � conserve d'une part les protozoaires dans un �levage dit "infectieux" et proc�d� � leur multiplication. Les individus composant cet �levage provenaient d'un grenier � ma�s infest�, installe sur le terrain d'essai de Cacaveli. Du fait que les populations naturelles du col�opt�re sont d�j� infest�es, jusqu'� un certain degr�, par des protozoaires, ces animaux pr�sentaient un taux d'infection "naturelle". On s'est efforce d'obtenir un taux d'infection aussi �lev� que possible au sein de la population d'insectes en ajoutant r�guli�rement des spores de protozoaires.

Il a fallu d'autre part constituer un �levage de P. truncatus sains pour servir d'animaux exp�rimentaux. Dans la mesure o� la contamination par les protozoaires ne s'accompagne dans la plupart des cas chez les d'aucun sympt�me visible il n'a pas �t� possible de s�lectionner les sujets sains parmi une population de ravageurs contamin�s naturellement. Il s'agissait donc tout d'abord de trouver des sujets non contamines. Afin de pr�server ces individus on a �lev� isolement plusieurs couples de l'anobie. Apr�s que ces couples se soient reproduits on a retir� les parents afin de d�celer chez eux une infestation �ventuelle par des protozoaires. Dans les cas o� les r�sultats d'examen ont �t� n�gatifs, on a pu en conclure que la descendance �tait �galement exempte d'infestation et pouvait �tre utilis�e pour l'�levage d'animaux sains. En renforcement de cette mesure on a proc�d� a des contr�les r�guliers dans les bocaux d'�levage pour v�rifier que les animaux �taient exempts de toute infestation par des protozoaires.

Dans le but de pr�server l'hygi�ne � l'int�rieur de l'�levage on a retire de temps � autre des bocaux de verre la poussi�re r�sultant de l'activit� alimentaire, de m�me que les cadavres d'insectes et rajoute du substrat nutritif. La pr�sence d'acariens a pos� des probl�mes particuliers. Afin de pr�venir une contamination par ces animaux les bocaux d'�levage et les bocaux � essai ont �t� syst�matiquement places dans des assiettes de plastique remplies de paraffine. Pour maintenir les acariens � distance les �tag�res supportant les bocaux ont �t� nettoy�es chaque semaine dans une lessive savonneuse. Les pieds des �tag�res ont �t� eux aussi plac�s dans des conteneurs remplis de paraffine

Origine et conservation du substrat nutritif

Comme substrat nutritif pour les �levages et les bocaux a essai, on a choisi diverses esp�ces locales de ma�s pr�sent�es sous forme de grains en vrac. Ce ma�s provenait des zones de culture situ�es dans le sud du Togo. Apr�s d�panouillage et �grenage des �pis, les grains intacts ont �t� tri�s, tamis�s et plac�s dans des sachets de plastique pour cong�lation. Ce processus visait � tuer les insectes nuisibles et les acariens �ventuellement demeures dans le grain. A l'issue d'une p�riode minimale de cong�lation d'une semaine les grains ont �t� d�congel�s et utilises pour les (levages ou les pr�parations destin�es aux essais.

Appareillage et produits chimiques utilis�s

Comme conteneurs d'�levage et d'essai, on a choisi des bocaux de 1 l (marque Leifheit, type "Einkochspa�" ). Ces bocaux se sont r�v�l�s particuli�rement adapt�s en raison de la perforation pratiqu�e dans le couvercle, dans laquelle on a mis un morceau de treillis en acier sp�cial d�coup� sur mesure permettant d'assurer une alimentation suffisante des insectes en oxyg�ne. S'agissant du couvercle, le choix du mat�riau pr�sentait certaines difficult�s dans la mesure ou l'anobie est capable de traverser de nombreux mat�riaux (cf. DETMERS, 1988), ce qui explique que l'on ait choisi un treillis � mailles fines en acier sp�cial.

Pour les essais ne r�unissant qu'un nombre restreint d'individus, on a utilis� de petits bocaux � collet de 10 ou de 50 ml. Le choix des conteneurs a �t� en l'occurrence dict� par le nombre d'individus � placer dans ch�que bocal.

2.3 M�thodes

2.3.1 Recensement de Ia pr�sence naturelle d'agents pathog�nes sur Prostephanus truncatus au Togo
2.3.2 Examen d'une �ventuelle infestation des insectes par des protozoaires
2.3.3 Coloration des spores et �tude du cycle �volutif
2.3.4 Examen histopathologique
2.3.5 Confection de la pr�paration aux spores de protozoaires et d�teramination de la concentration des spores

2.3.1 Recensement de la pr�sence naturelle d'agents pathog�nes sur Prostephanus truncatus au Togo

Afin de d�terminer de l'infestation naturelle de P. truncatus. par des agents pathog�nes au Togo, on a proc�d� en janvier et f�vrier 1989 a un recensement dans les principales zones de distribution du ravageur des stocks. Les greniers � ma�s inspectes chez les petits paysans �taient repartis au total sur 108 villages. L'objectif consistait ici � d�celer une �ventuelle infestation due � l'anobie.

Dans l'un des greniers, qui pr�sentait des signes visibles de la pr�sence de P. truncatus. on a �t� les (pis infest�s pour les conserver dans des sacs de coton. Le m�me jour, on a s�par� au laboratoire les col�opt�res vivants trouv�s sur les �pis des col�opt�res morts. Les animaux vivants ont �t� ensuite tues � l'ac�tate d'�thyle. Pour chaque lieu de d�couverte, on a s�lectionn� au maximum, suivant le principe de hasard, 12 col�opt�res vivants et 12 col�opt�res morts afin de rechercher sur eux une �ventuelle infestation par des agents pathog�nes.

2.3.2 Examen d'une �ventuelle infestation des insectes par des protozoaires

Les animaux infectes ont �t� examines syst�matiquement par la m�thode du diagnostic individuel. Pour effectuer cette analyse, on a nettoy� l'insecte a examiner dans de l'eau distill�e afin d'en retirer la farine de ma�s issue de l'activit� alimentaire. On a ensuite d�tach� la t�te, le thorax et les �lytres. L'abdomen a �t� place sur un porte-objet et �cras� dans une goutte d'eau distill�e. Cette pr�paration �cras�e dite "de l'�tat naturel'. a ensuite �t� examin�e au microscope afin d'y d�celer d'�ventuelles spores de protozoaires. L'enveloppe de l'abdomen a �t� conserv�e en vue d'autres examens.

En pr�sence d'un nombre �lev� de sujets, comme dans le cadre des essais portant sur la dynamique des populations, il n'a pas �t� possible d'examiner tous les animaux individuellement. Pour d�terminer le taux d'infection, on a pr�lev� ici un �chantillonnage de 50 individus. Selon nos propres tests, le taux d'infection constat� sur cet �chantillonnage correspondait largement au taux d'infection effectivement relev� sur l'ensemble des animaux examin�s

2.3.3 Coloration des spores et �tude du cycle �volutif

Il s'agit dans l'expose qui suit de m�thodes standardis�es pour l'examen des agents pathog�nes des insectes. Les travaux ont �t� r�alis�s avec l'aimable collaboration du Dr Huger de Darmstadt (BBA).

L� o� le diagnostic �tait positif, on a confectionn� plusieurs frottis secs, obtenus � partir de l'abdomen de l'animal infect�, lequel contenait des spores. Apres 10 minutes de fixation sans du m�thanol, les frottis ont (t� color�s pendent 60 minutes au Giemsa. Les pr�parations color�es ont �t� recouvertes d'Entellan. De mani�re � d�terminer les dimensions des spores de Nosema et de Mattesia. on a photographie les divers stades de l'�volution. Afin d'�tablir le rapport nucl�aire a l'int�rieur des spores de Nosema, on a confectionn� des colorations de noyau. S'agissant de ce type de coloration, les frottis secs ont �t� hydrolys�s apr�s fixation dans 1 N de solution d'HCl � 55 �C. La coloration optimale des noyaux au Giemsa a �t� obtenue apr�s 10 minutes d'hydrolyse.

Autre caract�ristique des spores de Nosema c'est-�-dire la longueur de leur filament polaire. Dans le but d'examiner cette caract�ristique plus en d�tail, on a utilise des pr�parations de l'�tat naturel s�ch�es, dans lesquelles, ainsi que l'exp�rience l'a montre, les spores �jectent leur filament polaire. Les photos prises on: permis de mesurer la longueur de ces filaments polaires.

L �tude du cycle �volutif de l'esp�ce Nosema devrait permettre d'en tirer des conclusions quant � son identit�. Pour pouvoir d�crire les Stades interm�diaires de la microsporidie, on a pr�par� dans un premier temps des larves infest�es. Apr�s avoir tut et nettoy� les sujets, on a proc�d� � une coupe ventrale longitudinale, suivie de l'ablation du corps adipeux, des gonades et de l' intestin moyen La coloration au Giemsa des frottis d'organes fix�s a �t� effectu�e selon la m�thode connue. Les pr�parations ont �t� ensuite examin�es d'in d'�tablir les stades du d�veloppement de l'esp�ce Nosema. Ces stades ont �t� photographi�s, de fa�on � pouvoir d�crire � l'aide des photos le cycle �volutif du protozoaire.

2.3.4 Examen histopathologique

Dans le but d'identifier les microsporidies, on a �tudi� les transformations histologiques intervenant dans l'animal h�te infest�. La confection de coupes sagittales sert � rendre visible chacun des organes de l'animal h�te, ce qui permet de les examiner pour y d�celer une infection �ventuelle. On a donc proc�d� sur les larves de Nosema � toute une s�rie de coupes de ce type.

Les larves infest�es ont tout d'abord �t� incluses dans de la cire. On a ensuite proc�d� sur ces larves � des coupes transversales de 8 �m d'�paisseur. Pour �tre certain d'atteindre tous les organes, on a sectionne l'animal jusqu'en son milieu. Les coupes microscopiques ont �t� ensuite color�es � l'h�matoxyline-liquide de Heidenhain. Le proc�d� utilise �tait conforme � une m�thode standardis�e (HUGER, communication orale).

2.3.5 Confection de la pr�paration aux spores de protozoaires et d�termination de la concentration des spores

Pour obtenir une pr�paration aux spores de protozoaires r�unissant les deux agents pathog�nes, on a employ� des col�opt�res morts provenant de l'�levage infeste, � partir desquels on a confectionn� dans un mortier une poudre tr�s fine. Pour certains essais, toutefois, l'inoculation d'un seul type de spores �tait requise. Pour r�aliser les pr�paration aux spores simples, on a transform� les cadavres des animaux d�j� examines en une poudre hautement concentr�e de spores de Mattesia et de Nosema. Des P. truncatus sains ont �t� alors plac�s sur le substrat ainsi obtenu, ce qui fait que leur descendance a elle aussi �t� contamin�e par l'un ou l'autre des protozoaires, Ce sont ces animaux infestes qui ont �t� utilis�s pour la confection des pr�parations simples.

La concentration des spores dans chaque pr�paration a �t� d�termin�e selon une m�thode unique, dont nous allons traiter ici sous une forme r�sum�e. Cette concentration on a �t� d�termin�e sur la base d'un �chantillonnage de 20 mg de chaque type de pr�paration aux spores. Chacun des �chantillons a �t� plac� en suspension dans I ml d'eau distill�e, puis centrifuge durant quelques minutes dans une centrifugeuse manuelle. Le reste, qui contenait les spores d�tach�es. a �t� transf�r� � l'aide d'une pipette dans un h�matim�tre de Thoma, dans lequel on a effectue la num�ration des spores. La moyenne des r�sultats obtenus � la suite d'un triple comptage a permis d'�tablir la concentration de spores dans l'ensemble de la pr�paration. Dans d'importantes quantit�s de pr�parations aux spores utilis�es pour les essais en greniers, la d�termination de la concentration a �t� op�r�e � partir de plusieurs �chantillons de 20 mg.

2.4 Essais en conteneurs

2.4.1 Inoculation de spores de protozoaires a des larves et � des adultes de Prostephanus truncatus
2.4.2 Observation de couples infestes par Mattesia
2.4.3 Traitement de populations de Prostephanus truncatus aux spores
2.4.4 Inoculation de spores stock�es
2.4.5. Essais de transmissibilit� des spores de protozoaires � d'autres esp�ces de col�opt�ras
2.4.6 Traitement combin� aux insecticides et aux pr�parations aux spores de protozoaires

2.4.1 Inoculation de spores de protozoaires a des larves et � des adultes de Prostephanus truncatus

Les diff�rents stades du d�veloppement de P. truncatus ont �t� inocules avec des spores de Mattesia et de Nosema afin que l'on puisse �tudier pour chaque stade les effets pathog�nes de ces deux protozoaires. Les larves et les adultes ayant �t� inocules selon des proc�d�s diff�rents. nous d�crirons dans la suite ces proc�d�s l'un apr�s l'autre.

Inoculation des larves

Les traitements aux spores de Nosema et de Mattesia ont �t� respectivement appliqu�s � 16 larves saines des ler, 2�me et 3�me stades (L1, L2 et L3) de P. truncatus. Pour identifier les stades larvaires, on a mesur� la largeur de la capsule C�phalique (d'apr�s SUBRAMANYAM et al., 1985). Dans un petit bocal � collet, rempli pour moiti� environ de farine de ma�s comprim�e, on a place quatre larves du m�me stade. Ces larves ont Et� positionn�es � la surface de la poussi�re, dans des cavit�s pr�form�es, puis saupoudr�es uniform�ment de 40 mg de chacune des poudres aux spores. On a ainsi introduit dans chaque verre 2x10⁷ spores de Nosema et 4x10⁶ spores de Mattesia. Apres avoir ainsi traite les larves, on a verse � nouveau de la farine de ma�s dans les conteneurs, en ne la comprimant cette fois que l�g�rement Les conteneurs ont �t� refermes au moyen d'un morceau de gaze.

L� o� l'on a utilis� de la farine de ma�s non tamis�e le taux de mortalit� des larves �tait dans l'ensemble �lev� ce qui a conduit � r�p�ter les inoculations de I mm de farine de ma�s finement tamis�e Chaque conteneur contenait 6x10⁷ spores de Nosema et 4x10⁵ spores de Mattesia. A l'issue d'une p�riode d'essai de 19 jours pour L3, de 26 jours pour L2 et de 33 jours pour L1, on a �tabli les taux de d�veloppement et de mortalit� et d�nombr� les animaux contamin�s.

Inoculation des adultes

Afin de v�rifier leur pr�disposition, on a inocul� aux adultes de P. truncatus les deux types de spores en m�langeant la poudre contenant les spores aux grains de ma�s en vrac. Pour ce qui est du traitement aux spores de Nosema, on a utilis� douze bocaux � collet de 10 ml, que l'on a remplis � chaque fois de 5 g de ma�s en grains. Dans quatre de ces bocaux, on a introduit la pr�paration � une concentration de 8X10⁶ spores pour 1 g de substrat. Dans quatre autres bocaux, on a introduit 8x10⁵ spores par gramme de substrat. Les quatre bocaux restants n'ont pas �t� trait�s. On a ensuite plac� dans chaque conteneur 20 sp�cimens sains de P. truncatus. Pour l'inoculation des spores de Mattesia, on a rempli douze bocaux � collet de 25 g de ma�s en grains. Quatre de ces bocaux ont �t� trait�s au moyen de 4x10⁴ spores et quatre autres au moyen de 2x10⁴ spores par g de substrat. Les bocaux restants n'ont pas �t� trait�s. On a ensuite plac� dans chaque bocal 30 adultes de P. truncatus. Dans les deux essais a inoculation, les col�opt�res ont �t� examin�s au bout de trois semaines afin de d�celer une infestation �ventuelle par les protozoaires.

2.4.2 Observation de couples infestes par Mattesia

Dans le but de d�terminer la f�condit� et la long�vit� du ravageur � la suite d'une infestation par Mattesia, on a place en observation des couples de P. truncatus dont les m�les ou les femelles �taient infest�s par l'esp�ce Mattesia. 200 larves exemptes d'infestation ont tout d'abord �t� pr�par�es, Apres qu'ils aient atteint la forme adulte, les animaux retir�s des bocaux d'�levage pr�sentaient une teinte l�g�rement brune. Cette coloration permet de conclure que le corps chitineux prot�geant les col�opt�res des blessures au cours de la m�tabolisation avait d�j� atteint une duret� suffisante. On a ensuite d�termin� le sexe � partir d'une caract�ristique secondaire localis�e sur la t�te des insectes (d'apr�s SHIRES & McCARTHY, 1976).

M�les et femelles ont d'abord �t� �lev�s s�par�ment, la moiti� des sujets �tant places sur un substrat contenant des Mattesia. Ce substrat �tait compos� de grains de ma�s en vrac, qui avaient �t� humidifi�s avec de l'eau, puis contamin�es par des spores. A la suite d'une p�riode d'incubation de quatre jours, on a proc�d� � la formation des couples suivants :

• 10 couples de P. truncatus sains
• 10 couples composes de femelles saines et de m�les infect�s et
• 10 couples composes de femelles infect�es et de m�les sains.

Le d�nombrement des oeufs pondus a commenc� entre quatre et six jours apr�s le d�but de l'essai. Le comptage s'est poursuivi durant 10 semaines, � intervalles de quatre jours. Avant de retirer les oeufs des bocaux � essai, on a sorti les adultes pour les examiner. Les animaux vivants ont �t� replac�s dans les conteneurs. A l'aide d'un pinceau, on a extrait avec pr�caution la farine de ma�s et les oeufs qu'elle contenait des grains attaques, puis s�par� dans un tamis � mailles de 0,315 T les oeufs de la farine de ma�s. Les oeufs, qui sont tr�s fragiles, ont �t� rassembles � l'aide d'un pinceau en poils de martre, nettoy�s � l'eau distill�e puis places dans une boite de Petri pour que l'on puisse observer quotidiennement l'�closion des larves. Les larves fra�chement �closes ont �t� imm�diatement examin�es en vue de d�celer une infestations par Mattesia. A chaque fois qu'une femelle mourait durant l'essai, on a tue le m�le pour l'examiner; dans le cas inverse, on a continue a observer la femelle survivante.

2.4.3 Traitement de populations de Prostephanus truncatus aux spores

Les deux essais suivants avaient pour objectif d'observer la dynamique des populations de P. truncatus sous l'influence des spores de protozoaires, Lors du premier essai, on a pris 60 sp�cimens de P. truncatus des deux sexes provenant d'un grenier � ma�s et pr�sentant par cons�quent un certain degr� d'infection naturelle par des protozoaires. Le second essai a �t� effectu� sur 10 m�les et femelles issus de l'�levage sain. Le proc�d� utilise �tait le m�me pour les deux essais.

On a vers� dans six conteneurs en verre de 1 l de contenance 300 g de grains de ma�s. Dans trois de ces conteneurs, on a m�lang� au grain une pr�paration mixte contenant des spores; les trois autres conteneurs n'ont pas �t� trait�s. Dans le premier essai, on a trait� � une concentration de 3x10⁵ spores de Nosema et de 8x103 spores de Mattesia par g de substrat, tandis que dans le second la concentration �tait de 3,5x10⁵ pour les spores de Nosema et de 3x10³ pour les spores de Mattesia.

Au bout de 4, 8, 12 et 16 semaines, on a proc�d� � l'�valuation des conteneurs. Pour ce faire, on a verse le contenu de chaque r�cipient dans un jeu de tamis comprenant un fond, ainsi qu'un tamis de 0,4 T, un de 0,8 T et un de 3,15 T. Le tri des individus a �t� facilite par l'utilisation de tamis � mailles de diff�rentes largeur. Les imagos, morts et vivants, de m�me que les larves mortes, ont �t� retir�s du tamis s�par�ment, puis d�nombr�s. On a ensuite pr�lev� un �chantillonnage de 50 individus, repr�sentant tous les stades du d�veloppement de P. truncatus, afin de rechercher une infection par des protozoaires. La farine de forage et les grains ont �t� replac�s dans leurs conteneurs respectifs pour permettre d'observer le d�veloppement ult�rieur du reste des oeufs, des papes et des larves de l'anobie. A l'issue d'une p�riode d'essai de 16 semaines, on a d�nombr� dans chaque conteneur la totalit� des individus.

2.4.4 Inoculation de spores stock�es

Il s'agissait de v�rifier par deux essais si la contagiosit� des spores de Nosema et de Mattesia diminuait � la suite d'un stockage. Un autre essai avait pour but d'�tablir � quelle temp�rature les spores pouvaient survivre le plus longtemps.

Pour r�pondre � la premi�re question, on a stocke les spores dans des cadavres d'animaux durant des p�riodes plus ou moins prolong�es. Il s'agissait en l'occurrence d'animaux provenant de l'�levage de P. truncatus � infection mixte. Pour pr�parer les poudres aux spores, on a moulu simultan�ment les col�opt�res morts qui avaient �t� conserv�s pendant la m�me dur�e. Les diverses poudres aux spores ont �t� alors inocul�es au moyen de la m�thode connue � 20 larves de P. truncatus par type de poudre (cf. chap. 2.4.1).

Un traitement r�alis� sur la base d'une pr�paration confectionn�e � partir de spores r�centes fournissait le t�moin. La dur�e de conservation et les quantit�s de spores appliqu�es figurent au tableau 1. Par rapport � l'essai 1, on a utilis� pour le traitement de l'essai 2 une quantit� de poudre trois fois sup�rieure, ce qui fait que le nombre de spores par conteneur a triple. Les animaux infect�s ont �t� d�nombr�s au bout de 14 jours (essai 1) et de 10 jours (essai 2).

Dans le cadre d'un autre essai, on a conserve la pr�paration aux spores mixtes a diff�rentes temp�ratures. Apres que l'on ait eu d�termine la concentration de spores, la poudre a �t� divis�e en 6 portions �gales et conserv�e dans des sachets de plastique. On a stock� au laboratoire deux sachets de chaque sorte, d'une part � la temp�rature normale (23 a 32 �C), en r�frig�rateur entre 4 et 10 �C, et enfin en cong�lateur par une temp�rature de -12 � -22 �C. Au bout de deux mois, on a retir� un sachet de chacune des zones de temp�rature afin d'inoculer les spores de conservation au ravageur. L'op�ration a �t� r�p�t�e par la suite avec les trois autres sachets au bout de huit mois de stockage.

Tabl. 1: Dur�e de stockage des cadavres d'animaux et des spores de Nosema (No.sp.) et de Mattesia (Ma.sp.) appliqu�es respectivement � 4 larves de Prostephanus truncatus (essais 1 et 2)

Comme animaux exp�rimentaux, on a pris 40 larves de P. truncatus saines, que l'on a trait�es aux diff�rentes poudres de spores en vertu de la m�thode pr�c�demment d�crite. La quantit� appliqu�e � l'ensemble des variantes �tait de 2X10⁸ spores de Nosema et de 6x10⁵ spores de Mattesia. par conteneur. A l'issue d'une p�riode d'essai de 10 jours, on a compte le nombre de sujets infect�s.

2.4.5. Essais de transmissibilit� des spores de protozoaires � d'autres esp�ces de col�opt�res

Il est fr�quent que le spectre d'h�tes des protozoaires pathog�nes des insectes ne soit pas limite � un h�te unique, mais que les protozoaires infestent au contraire diverses esp�ces d'insectes. Il s'agissait donc de voir si les esp�ces Mattesia et Nosema �taient elles aussi en mesure d'infester d'autres col�opt�res. Outre les six ravageurs des stocks retenus pour ce test, on y a �galement int�gr� T. nigrescens. Eu �gard � l'essaimage de cet antagoniste efficace de P. truncatus, pr�vu au Togo pour la fin de 1990, il �tait en effet important' du point de vue pratique, de v�rifier chez lui une pr�disposition �ventuelle.

Inoculation des ravageurs des stocks

On trouvera au tableau 2 la liste des esp�ces de ravageurs des stocks choisis pour l'essai, ainsi que les divers substrats sur lesquels ils ont �t� plac�s. Les substrats nutritifs utilis�s sont ceux sur lesquels les col�opt�res concernes ont �t� trouv�s � l'origine. Du fait que les �levages d'insectes �taient d�j� tous infestes par des microsporidies et que l'on y avait observe dans certains cas des infections dues � des n�ogr�garines, il a fallu dans un premier temps s�lectionner des animaux sains. Le proc�d� employ� en l'occurrence �tait identique � celui d�crit au chapitre 2.2, concernant l'�levage de P. truncatus exempts d'infestation.

La descendance saine des ravageurs a �t� soumise a un traitement aux spores compose de poudres aux spores mixtes hautement concentr�es (de 3x10⁷ � 8x10⁸ spores de Nosema et de 5x10⁵ � 1x10⁷ spores de Mattesia. par conteneur). Un contr�le d'infestation a �t� effectu� au bout de � semaines (4 semaines pour D. bifoveolatus).

Tabl. 2 : Ravageurs des stocks � qui ont et scores de ptotozoaires

Essai destin� � �tablir la pr�disposition de Teretriosoma nigrescens dans une population de P. truncatus infest�e

Dans le cadre de cet essai pr�liminaire, on a place 30 adultes de T. nigrescens sur une population de P. truncatus fortement infest�e par des protozoaires. Au bout de 13 semaines, on a v�rifi� le contenu du r�cipient afin de recenser les P. truncatus survivants et de rechercher sur les T. nigrescens une �ventuelle infection par les protozoaires.

Essai avec des proies infest�es

Apres avoir pris 25 bo�tes de Petri en verre et en avoir garni le fond d'un morceau de papier, on a introduit dans chacune d'elles 4 larves et 4 adultes de P. truncatus infestes, puis 1 adulte de T.nigrescens par boite. De la m�me mani�re, 30 larves de T. nigrescens ont �t� nourries avec des larves malades de l'anobie. Au bout de 6 jours environ, on a remplac� dans toutes les boites les proies infest�es par des proies saines, et cela de mani�re � �viter un diagnostic d'infestation positif d� � la pr�sence de spores dans l'appareil digestif de T. nigrescens. Pour �tre � peu pr�s certain que l'appareil digestif des pr�dateurs �tait exempt de spores, on a ensuite nourri ces pr�dateurs pendant 24 jours avec des proies saines. Ce n'est qu'� l'issue de cette p�riode que l'on a examine les T. nigrescens dans le but de d�celer chez eux une �ventuelle infestation par des protozoaires.

2.4.6 Traitement combin� aux insecticides et aux pr�parations aux spores de protozoaires

Dans la perspective du d�veloppement d'une strat�gie de lutte biologique int�gr�es il est indispensable de conna�tre les interactions des principes actifs et des spores de protozoaires. Il s'agissait par cons�quent de d�terminer, dans le cadre d'un essai pr�liminaire, si la contamination de spores de protozoaires par une poudre insecticide att�nue la virulence des spores. A la suite de cela, on a donc applique simultan�ment du pirimiphos-m�thyle (la concentration de mati�re active de la pr�paration utilis�e, qui s'appelle dans le commerce "Actellic", est de 2 %) associ� � la pr�paration aux spores, aux fins d'�tudier les effets d'un traitement combin� sur la population de P. truncatus.

Essai pr�liminaire

On a tout d'abord pil� grossi�rement dans un mortier quelques centaines de P. truncatus morts provenant de l'�levage infest�, puis pr�lev� sur cette fraction �cras�e une quantit� de 20 mg, qu'on a moulus finement dans le but d'�tablir la concentration de spores (cf. chap. 2.3.5). La fraction �cras�e a �t� ensuite divis�e en � portions identiques, qui ont �t� plac�es dans des boites de Petri. On a me ange � chaque lot de la poudre de pirimiphos-m�thyle ou de deltam�thrine (la concentration de mati�re active de la pr�paration utilis�e, qui s'appelle dans le commerce "K-Othrine", est de 0,2%).

Au bout de 4 semaines de contamination, les insecticides pulv�ris�s ont �t� soigneusement isol�s des particules de col�opt�res � l'aide a un tamis de 1 mm. Apres nettoyage, les particules de col�opt�res ont �t� moulues en une fine poudre aux spores, laquelle a �t� inocul�e, selon le proc�d� habituel, � 40 larves de P. truncatus saines pour chaque type de poudre. Chaque conteneur renfermait en moyenne 5x10⁶ spores de Nosema et 3x10⁵ spores de Mattesia. Le contr�le d'infection des sujets est intervenu au bout de 13 jours.

Traitement de P. truncatus au pirimiphos-m�thyle et aux spores de protozoaires

Partant du fait que le "pirimiphos-m�thyle", qui est une liaison organophosphor�e, s'est av�r� dans le pass� une mati�re active insecticide moins efficace que les pyr�thro�des synth�tiques pour lutter contre P. truncatus (GOLOB et al., 1985), on a voulu ici analyser sur le ravageur les effets de la mati�re active associ�e � des spores de protozoaires. Pour ce faire, on a place dans des conteneurs en verre de 1 l 300 g de grains de ma�s, m�lang�s � du pirimiphos-m�thyle et des spores, et cela aux concentrations indiqu�es au tableau 3. S'agissant de la mise en oeuvre combin�e, on a m�lang� les pr�parations avant l'application. Chaque conteneur a accueilli 10 m�les et femelles de P. truncatus sains.

Les populations de ravageurs ont pu se d�velopper librement dans les conteneurs pendant 4, 8 et 12 semaines, �tant donne que l'on a pr�lev� � l'issue de chacune de ces p�riodes trois conteneurs par variante, que l'on a �limin� dores �valuation. Cette m�thode a permis de recenser � la fin de chaque p�riode la totalit� des sujets sains d'une population. L'op�ration ayant �t� r�p�t�e trois fois pour chaque variante, il a fallu utiliser neuf conteneurs par traitement. Au sein des populations trait�es aux spores, on a d�termin� les taux d'infection sur un maximum de 50 animaux par stade de d�veloppement.

Tabl. 3 : Variantes trait�es en conteneur � l'Actellic et aux spores de protozoaires (20 P. truncatus par conteneur)

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